目的 研究癌胚基因survivin在角膜上皮损伤修复中的作用。
方法 实验研究。运用免疫荧光染色法检测小鼠角膜组织中survivin表达情况;前后共选取三批BALB/c小鼠各12只建立角膜机械性损伤动物模型(角膜中央直径1.5mm上皮刮除),每批随机分成3组(设6小时、12小时、24小时三个时间点),每组4只。各组同样处理方法:左眼为正常对照,右眼为机械损伤。采用实时定量 PCR技术对小鼠角膜survivin及炎症相关基因 mRNA水平进行检测;同时选用人角膜上皮细胞系(human corneal epithelial cells,HCECs)建立机械性损伤细胞模型(细胞培养皿中央十字划伤贴壁上皮细胞),设计0.5、1、2、4、8、24小时损伤时间点,利用Western blotting与核浆分离技术对HCECs中survivin总蛋白水平和细胞核内水平进行检测;应用RNA干扰技术特异性敲低HCECs中survivin表达,采用MTS法检测上皮细胞活性及增殖水平,同时显微观察基因干扰与损伤后上皮细胞修复速度及修复面积。
结果 survivin仅表达于小鼠角膜上皮层中;在小鼠角膜损伤模型中,角膜损伤组的survivin基因表达量随时间增加,同时伴有6小时和24小时白介素6(IL6)及γ干扰素(IFNγ)表达量的增加;在细胞损伤模型中,HCECs损伤30分钟survivin蛋白表达量增加,1小时后表达量骤减,到8小时后恢复正常水平,24小时入核表达增加;转染survivin特异性siRNA进入HCECs后survivin表达显著降低,细胞数量仅为正常对照组的75%,同时损伤后上皮细胞划伤部位愈合速度缓慢(24小时后仅愈合50%,正常组100%),愈合面积小于对照组。差异具有统计学意义,p<0.05。
结论 survivin仅表达于角膜上皮且可以促进角膜上皮细胞的增殖及上皮损伤修复。 |